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一種捕獲尿液中膀胱癌細胞的新型微流控晶片的設計

來源 : 中國醫療設備 2018第4期
update : 2018/06/06
引言
膀胱癌是指發生在膀胱粘膜上的惡性腫瘤,是我國泌尿外科臨床上最常見的腫瘤之一。膀胱癌患者可表現出多種症狀,如血尿、尿急、尿頻、盆腔疼痛等,而90% 以上的膀胱癌患者最初的臨床表現症狀是血尿,然而出血量與血尿持續時間的長短,與腫瘤的惡性程度和大小沒有明顯關係,這是膀胱癌高致死率的重要原因[1]。如果早期發現,膀胱癌5 年生存率大概為94%,可見膀胱腫瘤的早期診斷可以極大地降低膀胱癌的致死率[2]。目前臨床上對於有尿路症狀患者的出診篩查和對膀胱癌術後患者的複查主要手段有尿脫落細胞學檢查、膀胱鏡檢查、尿路造影術和螢光原位雜交(Fluorescent in Situhybridization,FISH)等技術。其中尿脫落細胞學檢查屬於無創檢測,但是其敏感性較低[3] ;膀胱鏡檢查屬於有創檢測[4] ;尿路造影術不支持活檢[5] ;FISH 技術費用過高[6]。因此,亟需一種新的無創檢測方法,既擁有較高的敏感性和特異性,同時費用低廉,足以讓大部分患者可以承受。

應用於腫瘤細胞檢測的微流控晶片技術在近十年逐漸出現[7]。為了實現腫瘤細胞的檢測,首先必須完成在微流控晶片內對腫瘤細胞的高效抓捕。細胞捕獲的手段有很多,目前微流控晶片用到的細胞捕獲技術主要基於光學、電學、流體力學以及抗原抗體結合等原理,通過微流控晶片內部的特殊結構和其他的技術相結合也是常用的方法。高菊逸等[8] 設計出一種簡易的用於迴圈腫瘤細胞(CirculatingTumor Cell,CTC) 捕獲的一種玻璃— 聚二甲矽氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)型晶片。首先,玻片表面經過氧等離子、矽烷化處理,使玻片表面能夠固定特異性抗體;然後通過抗原抗體特異性結合捕獲靶細胞,捕獲率可高達92%。巧妙的結構設計同樣可以用於細胞的捕獲。Stott 等[9] 在晶片中設計出了一種人字形結構用於CTC 的捕獲,這種結構讓血液樣品在微流控晶片中充分混合以增加CTC 的捕獲效率,最後成功地在患有前列腺癌患者的血液樣品中捕獲觀察到了CTC。但截止目前,尚未見通過尿液抓捕檢測膀胱癌細胞的相關報導。

本文基於微流控晶片技術,通過設計晶片內部特殊的抓捕結構,結合抗原抗體吸附反應特異性,探究抗體固定在晶片內表面的最佳條件,實現從尿液樣品中特異抓捕和鑒定膀胱癌細胞。

材料與方法
1.1 晶片設計與製備
結合目前已經成熟的捕獲腫瘤細胞的方法,設計中將抗原抗體免疫吸附反應原理結合到微流控晶片上,使其能夠準確檢測尿液樣品中可能出現的膀胱癌細胞,以此作為標準來判斷患者是否患有膀胱癌。晶片的流體通道結構,見圖1。通道結構主要由尿液樣本入口、尿液樣品檢測單元和尿液樣本出口組成。

圖1 微流控晶片流體通道結構平面圖
注:a.微流控晶片結構圖;b.微流控晶片檢測單元;c.微流控晶片陽模;d.微流控晶片實物圖。其中圖1a中,1為尿液樣本入口;2為尿液樣品檢測單元;3為尿液樣本出口。

在檢測單元中,設置有半徑為25 μm 的圓柱體陣列。其中每一行相鄰圓柱之間圓心間隔100 μm ;相鄰兩行圓柱之間圓心所在直線平行;圓柱體陣列交錯分佈,間隔100 μm。圓柱體陣列之間的間隔恰好足夠腫瘤細胞通過並且可以起到延長實驗時間、減緩流速以及增加膀胱癌細胞的捕獲效率等一系列的作用。

該微流控晶片是透明的玻璃—PDMS 晶片,所有通道和腔室採用PDMS(瀋陽力天利源商貿有限公司)作為材料,並與0.17 mm 厚度的玻璃片鍵合密封,構成玻璃—PDMS晶片。

1.2 抗體固定條件探究
本文採用基於抗原抗體免疫吸附反應的方式抓捕並鑒定膀胱癌細胞,首先探究最適宜的抗體固定條件。採用氨丙基三乙氧基矽烷(Aminopropyltriethoxysilane,APTES)矽烷化修飾玻片表面,使其具有固定蛋白質抗體的能力。為了探究最佳的修飾玻片條件,本文使用異硫氰酸螢光素(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)標記的螢光抗體進行實驗,在顯微鏡下觀察拍照後使用影像處理軟體計算螢光強度,以螢光強度代表被固定在玻片表面的抗體量。將矽烷化玻片的時間分別設定為1、5 和20 min,在其他實驗條件完全相同的狀況下進行實驗,觀察螢光強度並分析。隨後在矽烷化時間相同的情況下,將抗體孵育的時間分別設定為1.5、2 和2.5 h,再次觀察螢光強度並分析。

1.3 膀胱癌樣品鑒定
取膀胱癌患者18 例的病理組織作切片(大連市友誼醫院)作為驗證,病理切片採用經典的蘇木精—伊紅染色法(Hematoxylin-Eosin Staining,HE)進行染色,通過常規組織形態學判斷是否是膀胱癌組織。同時取50 mL 膀胱癌患者的尿液樣品,置於臺式高速低溫離心機中以800 G 離心力離心10 min,小心去除上清廢液。將離心後得到的細胞置於玻璃底培養皿中,採用免疫螢光進行膀胱癌細胞的鑒定。在玻璃底培養皿裡加入膠原促使細胞粘附在玻璃底上,在顯微鏡下觀察確認細胞的存在後向培養皿內加入1:200 磷酸鹽緩衝液(Phosphate Buffered Solution,PBS)稀釋的膀胱癌細胞特異性抗體Rabbit Anti-CD15 antibody,將玻璃底培養皿置於濕盒中4℃過夜;隨後取出培養皿,使用PBS 清洗3遍洗去多餘的一抗,隨後向培養皿中加入1:100 PBS 稀釋的FITC 標記的螢光二抗Anti-Rabbit IgG,在37℃培養箱中孵育1~2 h 之後置於螢光顯微鏡下觀察是否有帶螢光的細胞。

1.4 膀胱癌細胞的抓捕鑒定.....完整